00:00:00: Janika Kiltz Was ist eigentlich ein Referenzgenom und wofür wird es benötigt? In der Genomforschung suchen Wissenschaftler und Wissenschaftlerinnen in unserer DNA nach unterschiedlichen Varianten, also nach geänderten Buchstabenabfolgen in unserem DNA Code. Aber das Suchen und Finden dieser Varianten ist gar nicht mal so einfach. Welche Abfolgen gelten denn eigentlich als Standard und welche als Varianten? Wie soll man Änderungen und Unterschiede feststellen, wenn man gar nichts zum Vergleichen hat? Man braucht also zuerst einen offiziellen Maßstab und hier kommt das Referenzgenom ins Spiel. Aber jeder von uns ist genetisch unterschiedlich und das macht das Festlegen eines Maßstabs für alle doch recht knifflig. Was das genau bedeutet, welche Relevanz das für die Genomforschung hat und wie man das aktuelle humane Referenzgenom noch etwas verbessern könnte, darüber möchte ich heute mit meinen beiden Gästen sprechen. „Der Code des Lebens“ wird präsentiert von GHGA, dem Deutschen Humangenom-Phänomarchiv. Viel Spaß bei der heutigen Folge „Wofür braucht man einen Referenzgenom?“ Willkommen zum „Code des Lebens“! Jeden Monat erklären Experten und Expertinnen spannende Themen innerhalb der Genomforschung. Für die heutige Folge zum Thema humanes Referenzgenom durfte ich zwei Experten aus Düsseldorf befragen, Professor Dr. Tobias Marschall und Jana Ebler. Könntet ihr euch für die Zuhörer und Zuhörerinnen kurz vorstellen?

00:01:38: Jana Ebler Ja, ich bin Jana. Ich bin Doktorandin am Institut für Medizinische Biometrie und Bioinformatik an der Uniklinik in Düsseldorf. Und ja, ich bin Bioinformatikerin und ich beschäftige mich damit, Algorithmen zu entwickeln, mit denen man Sequenzierdaten auswerten kann.

00:01:57: Prof. Dr. Tobias Marschall Ja, danke schön. Danke, dass ich hier sein kann. Ich bin Professor an der Heinrich-Heine-Universität und leite das Institut für Medizinische Biometrie und Bioinformatik. Meine Arbeitsgruppe beschäftigt sich schon lange mit vielerlei Algorithmen, um Sequenzierdaten auszuwerten, in Bezug auf verschiedene Aspekte. Einer davon ist Genome Assembly, also das heißt das Zusammensetzen von Genomen aus Sequenzierdaten, aber auch vielen anderen Dingen, wie insbesondere auch das Thema Pangenomik, das sicherlich heute auch noch zur Sprache kommen wird.

00:02:33: Janika Kiltz Genau, da werden wir auf jeden Fall noch drauf zu sprechen kommen. Aber zunächst einmal müssen wir natürlich den Elefanten im Raum beseitigen: Was ist denn nun ein Referenzgenom?

00:02:45: Jana Ebler Also im Prinzip ist ein Referenzgenom einfach eine Nukleotid-Sequenz, die repräsentativ für die Genomsequenz, in dem Fall des Menschen, verwendet wird. Man kann sich das einfach gesagt vorstellen, als ein sehr, sehr langes Wort. Also sehr, sehr lang in dem Fall bedeutet eben drei Milliarden Buchstaben langes Wort, was aus den Buchstaben A, C, G und T besteht, die eben für die vier Basen stehen. Also Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin. Und Referenzgenome sind halt eben sehr hilfreich, wenn es darum geht, ja, die DNA zu analysieren. Beispielsweise benutzt man Referenzgenome, wenn man genetische Varianten in der DNA erforschen möchte.

00:03:33: Janika Kiltz Wie kann ich mir vorstellen, dass man das einsetzt?

00:03:36: Prof. Dr. Tobias Marschall Ja, das ist eine gute Frage. Wir wissen ja, dass menschliche Genome, also wenn wir beide jetzt unsere Genome miteinander vergleichen würden, würden wir finden, dass diese jeweils drei Milliarden Basenpaare, um ganz genau zu sein, zwei Mal drei Milliarden Basenpaaren, weil jeder von uns erbt ja ein Genom von der Mutter und vom Vater. Dass diese sich unterscheiden würden an, ja, weniger als ein Prozent der codierten Buchstaben. Das heißt, wir haben also Genome, die 99 Prozent identisch sind. Und die Unterschiede sind natürlich das, was uns interessiert. Das ist das, was uns beide genetisch voneinander unterscheidet. Und da aber auch so viele gleich sind, kann man sich jetzt zu Nutze machen, ein Referenzgenom zu verwenden. Also man kann das sich so vorstellen, dass wir aus dem Sequenziergerät viele kleine Sequenzstücke nur rauskriegen. Kann man sich vorstellen wie ein Puzzle im Grunde. Wir kriegen jetzt die einzelnen Puzzleteile vor die Füße geschmissen auf Deutsch gesagt und müssen jetzt rausfinden, geben diese Puzzleteile, die zusammen mein Genom ergeben würden, was sind jetzt die Unterschiede zwischen meinem Genom und deinem Genom. Und da hilft es natürlich, wie jeder, der schon mal ein Puzzle gemacht hat, weiß, da hilft es natürlich, das Bild auf der Schachtel zu haben. Und im Grunde ist das das Referenzgenom – ein Beispiel für ein mögliches menschliches Genom, mit dem man seine Puzzleteile vergleichen kann. Und wo man sagen kann, okay, das Teil kam jetzt von der Stelle. Und dann kann ich mir das eine Teil angucken und sagen, okay, hier ist jetzt ein Unterschied zwischen dem Puzzleteil aus meinem Genom und dem Referenzgenom. Und das mache ich dann mit meinem Genom und mit deinem Genom. Und dann habe ich im Grunde eine gute Idee, wo die Unterschiede sind, die ich dann jeweils durch Vergleich mit dem Referenzgenom, ja, im Grunde als Tabelle aufschreiben kann oder aggregieren.

00:05:34: Janika Kiltz Ein Referenzgenom ist also ein Beispiel für ein mögliches Genom. Also quasi eine festgelegte Abfolge der DNA-Basen A, C, T und G in einer langen Kette. Ja, und Forschende orientieren sich an diesem Genom, um Genome miteinander vergleichen zu können. Ja, außerdem dient das Referenzgenom als eine Art Karte der Positionen unserer einzelnen Gene. Tobias drückt es wie folgt aus:

00:06:01: Prof. Dr. Tobias Marschall Also wenn wir jetzt uns austauschen wollen und sagen, ich rede über die genetische Variante, würde ich immer sagen, sie liegt relativ zum Referenzgenom an Position 2354 auf Chromosom 13. Und dann weißt du ganz genau, von welcher Stelle ich spreche und allein deshalb ist es schon eigentlich nicht wegzudenken.

00:06:17: Janika Kiltz Genau, wir können festhalten: Ohne ein Referenzgenom ist Genomforschung nicht möglich. Das aktuelle Referenzgenom wird außerdem überall auf der ganzen Welt eingesetzt. Es hat also nicht jede Region ihr eigenes. Und ja, das macht natürlich Diskussionen über das menschliche Genom und auch die Zuordnung von Genen deutlich einfacher, wenn eben nicht jeder seine eigene Karte verwendet, sondern alle dieselbe Grundlage teilen. Und dieser globale Standard wird übrigens durch renommierte Forschungsinstitutionen wie dem EBI in Europa und dem NCBI in Nordamerika überprüft. Ja, und je genauer und vollständiger das Referenzgenom ist, desto mehr genetische Zusammenhänge können verstanden werden. Und deswegen hat das Referenzgenom beispielsweise auch einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung von Medikamenten und Therapieansätzen, da es ja auch bei der Zuordnung von krankmachenden Genen hilft. Gut, aber wo genau kommt denn nun dieses Referenzgenom eigentlich her? Kann man denn das auf eine Person zurückführen?

00:07:26: Jana Ebler Also tatsächlich ist es so, dass dieses Referenzgenom keine reale Sequenz ist von einer einzigen Person, sondern im Prinzip eine Kombination aus mehreren Genomen. Also man hat ja Daten von mehreren Menschen verwendet, um dieses Referenzgenom zu erstellen. Es ist also keine einzelne, reale Person.

00:07:49: Prof. Dr. Tobias Marschall Gut, im Falle des menschlichen Referenzgenoms ist tatsächlich so, dass sich das zurückverfolgen lässt auf das ursprüngliche Human Genome Project, das ja das erste, also vor gut 20 Jahren das erste Assembly eines menschlichen Genoms gemacht hat. Und da wurde schlicht und ergreifend über Zeitungsannoncen Teilnehmer gesucht.

00:08:10: Janika Kiltz Wirklich?

00:08:11: Prof. Dr. Tobias Marschall Ja, das ist wirklich so. Und ich glaube, es sind so rund 20 Leute gewesen, die damals sich gemeldet haben auf irgendeine Zeitungsannonce in New York und die ihr Genom zur Verfügung gestellt haben. Und ein großer Teil des jetzt heute noch verwendeten Referenzgenoms lässt sich zurückverfolgen zu wirklich einer Person, die sich damals gemeldet hat, aber eben nicht nur dieser einen Person, sondern es ist im Grunde ein Mix aus diesen 20 zufällig ausgewählten Personen von vor 20 Jahren aus New York.

00:08:44: Janika Kiltz Der erste Entwurf des humanen Referenzgenoms, der 2003 veröffentlicht wurde, war also eine zufällige Auswahl an Genomen. Also die Freiwilligen wurden nicht auf Grundlage ihres Genoms oder irgendwelchen besonderen Varianten ausgewählt, sondern es wurden einfach die Personen genommen, die sich freiwillig gemeldet haben, schon verrückt irgendwie. Das heutige Referenzgenom ist aber nicht mehr die genau gleiche Version wie noch vor 20 Jahren. Welche Entwicklungen gab es dann hier und welches Referenzgenom wird heutzutage offiziell verwendet?

00:09:18: Prof. Dr. Tobias Marschall Genau, also es hat dann natürlich auf Basis des ersten Assemblys vor, wie gesagt, rund 20 Jahren, das war relativ unvollständig. Es gab viele Lücken, auch einige Fehler und das ist natürlich über die Jahre immer weiter kuriert worden von einer Gruppe, die sich GRC, „Genome Reference Consortium“, nennt. Und da sind einige Lücken geschlossen worden, Fehler korrigiert worden über die Jahre und an manchen Stellen eben auch Varianten, die sehr selten sind. Also man hat dann gemerkt, es haben es manche Buchstabenfolgen an manchen Stellen ins Referenzgenom geschafft, die eigentlich extrem selten sind. An manchen Stellen hat man das dann ersetzt durch das sogenannte Major Allel, also die häufigere Variante, aber nicht systematisch und auch nicht überall. Es hat dann über die Jahre immer weitere Versionen gegeben und wir haben jetzt ein Referenzgenom, das sich GRCh38, also Version 38, nennt und das ist das am häufigsten verwendete Referenzgenom, wobei man dazusagen muss, dass in vielen Kontexten auch noch die Version davor verwendet wird. Also die wird insbesondere im klinischen Bereich noch sehr viel verwendet, obwohl wir wissen, dass sie ja einige Nachteile hat gegenüber der aktuellsten Version.

00:10:42: Janika Kiltz Die Verbesserung des humanen Referenzgenoms ist also ein unaufhörlicher Prozess. Fehler werden behoben und Lücken werden geschlossen. Aber was heißt „Fehler“ im Kontext eines Referenzgenoms? Ja, bei einem Referenzgenom werden viele kleine sequenzierte Abschnitte von Genom zusammengefügt, das nennt man Assembly. Dabei kann es sein, dass DNA-Basen falsch abgelesen wurden oder dass sequenzierte Teile zusammengefügt wurden, die in dieser Reihenfolge gar nicht zusammengehören. Neuere Versionen haben also weniger Fehler und Lücken als ihre Vorgänger. Aber wie kommt es denn dann, dass teilweise noch das alte Referenzgenom, also die Nummer 37, verwendet wird, wenn doch eben bekannt ist, dass die neuere Version weniger Fehler hat?

00:11:30: Prof. Dr. Tobias Marschall Ich denke, der Hauptgrund ist, dass viele… also das Referenzgenom an sich ist ja einfach nur eine Sequenz für jedes Chromosom. Das heißt also, das zu aktualisieren, wäre nicht so schwierig, aber was schwierig ist, ist die ganzen darum, existierenden Datenbanken zu aktualisieren. Wenn ich jetzt ein klinischer Genetiker bin, dann möchte ich natürlich auch die ganzen Kataloge verwenden, die mir sagen, die und die Variante ist vielleicht in dem und dem Krankheitsbild schon mal aufgetaucht oder hat die und die Bedeutung. Und diese ganzen Datenbanken, die sind erfahrungsgemäß sehr langsam dann auf die nächste Version upzudaten, sozusagen. Und das ist ein Grund. Der andere Grund ist natürlich auch, dass das Aufwand bedeutet und dass das für alle Nutzerinnen und Nutzer von dem Referenzgenom, der Aufwand, jetzt auf die nächste Version umzusteigen, auch irgendwie einen offensichtlichen Nutzen haben muss. Ansonsten denkt man sich, na gut, das hat immer so funktioniert, warum soll ich nicht die gleiche Version jetzt weiter nutzen, warum soll ich jetzt meine Workflows umbauen?

00:12:37: Jana Ebler Genau. Also ich denke, es kommt immer so ein bisschen auf die Anwendung drauf an. Für manche Sachen ist es eben relativ einfach, die Referenz zu wechseln, wenn es eine neue Version gibt. Und für manche Sachen ist das ein bisschen komplizierter.

00:12:50: Janika Kiltz Die Umstellung ist also mit einem großen Aufwand verbunden. Ja, und das geht mancherorts etwas schleppend vor sich. Was ist denn dann die besondere Motivation, das Referenzgenom kontinuierlich zu verbessern?

00:13:03: Prof. Dr. Tobias Marschall Dieses Referenzgenom, von dem wir jetzt gesprochen haben, was wir auch manchmal lineares Referenzgenom nennen, weil einfach eine Zeichenkette, eine Abfolge von Buchstaben für jedes Chromosom da ist, also eine lineare Kette. Die zu aktualisieren macht natürlich Sinn, weil, wie ich eben gesagt habe, Fehler repariert werden, aber auch Lücken geschlossen werden. Wir haben jetzt, ich muss inzwischen letztes Jahr sagen, also 2022 ist das erste wirklich lückenlose menschliche Genom überhaupt erst erschienen oder rekonstruiert worden von einem Konsortium namens T2T für „Telomere-to-Telomere Consortium“. Und das hat wirklich jetzt diese 20 Jahre gedauert von dem ersten humanen Genom bis zu dem ersten lückenlosen humanen Genom. Und das ist natürlich eine Motivation. Also wenn ich mir jetzt vorstelle, ich bin eine Forscherin, die sucht nach der Ursache für irgendeine Erkrankung. Und die Ursache liegt genau in dem Bereich, der in dem aktuellen Referenzgenom eine Lücke hat. Dann habe ich einfach keine Chance, meine Erklärung zu finden. Und das ist natürlich eine Motivation, upzudaten auf eine Version, die weniger Lücken enthält.

00:14:17: Janika Kiltz Ja, genau, das ist eine ganz neue Entwicklung. Das erste vollständige humane Referenzgenom wurde letztes Jahr sequenziert. Bisher, also seit 2003 der erste Entwurf eines menschlichen Referenzgenoms veröffentlicht wurde, fehlten also tatsächlich noch ganze 8% unserer DNA. Ja, und dieser Erkenntnisgewinn muss auch erst noch in das bestehende Referenzgenom eingearbeitet werden. Also vielleicht gibt es hier tatsächlich bald noch einen vollständigen Entwurf Nummer 39. Ja, aber auch geschlossene Lücken und behobene Fehler lösen leider nicht alle Probleme, die ein lineares Referenzgenom so mit sich bringt. Und zwar würde mich hier interessieren, ob dieses Referenzgenom das ja größtenteils auf Grundlage einer Person, die sich eben damals in New York gemeldet hat, erstellt wurde. Also ob dieses Referenzgenom für alle Bevölkerungsgruppen gleichermaßen geeignet ist. Denn also ich kann mir natürlich vorstellen, dass es da zu Problemen kommen kann, da eben nicht jede Genvariante jeder Populationsgruppe gleichermaßen abgebildet ist. Wie ist denn das? Können hier durch Nachteile entstehen?

00:15:26: Jana Ebler Ich bin mir nicht ganz sicher, welche Personen tatsächlich benutzt wurden, um das, also welche Daten benutzt wurden, um das aktuelle Referenzgenom auszuwählen. Aber ich gehe mal davon aus, dass es wahrscheinlich ja nicht wirklich alle Bevölkerungsgruppen oder Populationen gleich gut abdeckt. Und dann ist es tatsächlich schon so, dass das Nachteile haben kann. Also wenn das zum Beispiel nur Personen waren, die eben aus einer bestimmten Population stammen, dann hat man natürlich schon Nachteile, wenn man dann Personen analysieren möchte, die jetzt vielleicht aus einer anderen Gruppe stammen. Einfach, weil die Sequenzen dann unterschiedlicher sein können, auch in bestimmten Bereichen oder bestimmte genetische Varianten, die halt in einer anderen Population häufiger vorkommen sind, eben dann nicht repräsentiert. Also das kann schon auf jeden Fall Nachteile bringen.

00:16:18: Janika Kiltz Aha, das lineare Referenzgenom ist also eher nicht für alle Menschen gleichermaßen geeignet.

00:16:25: Prof. Dr. Tobias Marschall Genau, das ist in der Tat der nächste Handlungsstrang im Grunde, dass wir natürlich von Genom reden. Und das ist ja logischerweise das, was uns Menschen einzigartig macht. Und jetzt können wir natürlich anfangen zu fragen: „Funktionieren diese Analysen für jeden Menschen gleich gut?“ Und das Bild, das ich eben verwendet habe von dem Puzzle, wo ich jetzt ein Puzzleteil nehme und auf dem Karton suche, wo es hergekommen sein könnte, das funktioniert natürlich dann, wenn mein Puzzleteil ähnlich ist zu dem Bild, das ich da abgebildet habe. Wenn es jetzt vielleicht einen mini kleinen Unterschied gibt, der nur ein Bruchteil von dem Teil ausmacht, dann finde ich vielleicht trotzdem noch die Stelle, wo es hergekommen ist. Und in dem Bild, also die Entsprechung zu dem Bild wären eben sogenannte Snips, also Unterschiede in einzelnen Buchstaben. Also wenn ich ein einzelnes A gegen ein C ausgetauscht habe im Genom, dann habe ich eigentlich keine großen Probleme, diese Unterschiede festzustellen mit meinem Referenzgenom. Weil wenn ich ein Sequenzstück habe, das 150 Buchstaben lang ist und ein Buchstabe ist ausgetauscht, dann finde ich immer noch raus, wo das Stück hergekommen ist. Das Ganze sieht aber anders aus, wenn ich jetzt von größeren Unterschieden spreche, so genannten strukturellen Varianten, ein Thema, mit dem wir uns sehr intensiv beschäftigt haben. Und da kann es natürlich so sein, dass wenn ich jetzt einen größeren Unterschied habe, dass ich in dem Bild das ganze Puzzleteil nicht mehr zuordnen kann, dann fallen diese Teile natürlich unter den Tisch. Und das kann natürlich ein großes Problem sein, wenn angenommen in deinem Genom ist ein Sequenzabschnitt, der nicht im Referenzgenom repräsentiert ist, dann fällt dieses Stück einfach unter den Tisch bei der Analyse. Und das ist natürlich ein Problem und das ist insbesondere natürlich ein Problem, wenn wir jetzt von Sequenzstücken reden, die in manchen Populationen vielleicht häufiger sind als in anderen und wir dadurch sozusagen durch die Hintertür natürlich auch verschiedene Biases reinkriegen können in die Analysen, die mit der Herkunft zusammenhängen.

00:18:33: Jana Ebler Genauso, also das Problem ist natürlich, dass die Genome von Menschen nicht identisch sind. Also wir haben alle Unterschiede in unserer DNA, also genetische Varianten. Und ja, das führt eben dazu, dass sich bestimmte Bereiche in unserer DNA sehr stark auch teilweise unterscheiden können. Das Problem ist aber, dass das lineare Referenzgenom halt eben nur ein einziges Genom darstellt, also eine Version des menschlichen Genoms. Und das ist dann problematisch, wenn man eben solche Bereiche untersuchen möchte, in denen zum Beispiel oft Varianten vorkommen. Und ja, weil man dann eben diese ganze Information darüber, wie die Bereiche alternativ auch aussehen könnten, die hat man eben nicht repräsentiert in der linearen Referenz, weil da eben nur eine einzige Version ist. Und ja, das ist halt problematisch, weil solche variablen Regionen auch oftmals ziemlich interessant sein können biologisch. Und wenn man die dann eben erforschen möchte, dann kann das eben sehr problem… oder sehr schwierig sein mit der linearen Referenz. Und ich würde sagen, dass das eben das Hauptproblem ist. Also im Prinzip spiegelt die lineare Referenz eben nicht die Variabilität ab, die man in der Population sieht in der DNA.

00:19:50: Janika Kiltz Die genetische Variabilität ist nicht abgebildet. Aber was heißt „genetisch divers“ eigentlich? 99 Prozent unserer DNA mag identisch sein. Die restlichen 1 Prozent machen jedoch einen großen Unterschied.

00:20:05: Jana Ebler Genau, also es ist so, jeder von uns trägt halt Varianten in der DNA, also im Prinzip Mutationen, wo sich dann, manchmal ist es ist nur eine einzige Base, die sich unterscheidet. Manchmal können es aber auch ganze Abschnitte sein. Es kann zum Beispiel sein, dass bestimmte Personen eben Abschnitte in ihrer DNA nicht haben. Die sind da quasi gelöscht, die nennt man dann auch Deletion. Oder es kann auch sein, dass jemand zusätzlich Sequenz in seiner DNA hat, sogenannte Insertion. Und ja, die führen dann eben dazu, dass, wenn wir zwei Genome unterscheiden, dass wir halt eben diese Unterschiede sehen, beziehungsweise wenn wir ein Genom zur Referenz vergleichen, dass wir dann auch diese Unterschiede sehen. Und diese Mutationen haben natürlich dann auch, oder oftmals können die einen Einfluss auch haben auf unseren Phänotyp. Also insbesondere wenn Mutationen innerhalb von einem Gen zum Beispiel liegen, können die natürlich das Protein, das kodiert wird, durch das Gen beeinflussen. Und auf die Art und Weise kann es auch manchmal vorkommen, dass solche Mutationen eben auch Krankheiten hervorrufen.

00:21:13: Janika Kiltz Die allermeisten genetischen Varianten sind harmlos und bedeuten einfach, dass ich anders aussehe, als ihr da draußen. Meine braunen Haare sind genetisch anders kodiert, als eure blonden, roten oder schwarzen. Und ja, ich vertrage beispielsweise Milchprodukte, aber außerhalb Europas sind viele Menschen laktoseintolerant. Und diese genetischen Unterschiede machen uns zu dem, was wir sind, aber einige dieser Varianten können auch krankmachende Effekte haben. Also zum Beispiel, weil ein für uns wichtiges Protein durch eine geänderte Basenabfolge nicht mehr kodiert werden kann. Ja, und diese Unterschiede können nun problematisch werden, da, wie bereits besprochen, nur ein Genom im Referenzgenom abgebildet wird. Und da würde mich interessieren, kann man denn dann von einer Benachteiligung der Menschengruppen sprechen, deren Varianten eher nicht im Referenzgenom abgebildet sind? Also, denn das genetische Material des Referenzgenoms ist meiner Auffassung nach eher europäisch geprägt. Wie beeinflusst das denn nun Menschen, die eine andere Herkunft haben, also die beispielsweise aus Afrika stammen?

00:22:23: Prof. Dr. Tobias Marschall Ja, auch hier ist alles doch wieder ein bisschen komplizierter. Erstmal muss man natürlich… ich habe das heute Morgen nochmal nachgelesen. Es gibt Studien, die haben versucht, sich anzuschauen, welche Anteile im aktuellen Referenzgenom sich auf welche, sozusagen, Kontinente zurückverfolgen lassen. Und da gibt es Analysen, die sagen, dass ungefähr 57% des aktuellen Referenzgenoms europäisch aussieht. Und 37% afrikanisch und der verbleibende kleinere Teil dann über die anderen Kontinente. Also der größte… der Mensch, der den größten Anteil am aktuellen Referenzgenom hat, war offensichtlich europäisch und afrikanischer Abstammung mit einem Elternteil von beiden Kontinenten. So zumindest, was die genetische Analyse nahelegt an der Stelle. Was wir aber nicht vergessen sollten dabei, ist, dass die genetische Diversität innerhalb Afrikas um einiges größer ist, als die Diversität außerhalb Afrikas. Das hängt schlicht und ergreifend damit zusammen, dass wir denke ich alle wissen, die Wiege der Menschheit in Afrika liegt und dann gab es einige Migrationsbewegungen, wo die Menschen sich außerhalb von Afrika begeben haben. Und dieses, wir sagen genetisches Bottleneck dazu, hat dazu geführt, dass mehr Diversität innerhalb Afrikas verblieben ist, als eben den Kontinent verlassen hat. Und das sehen wir bis heute im Grunde, wenn wir die Genome analysieren, dass die Diversität unterschiedlich ist. Deshalb ist es gar nicht so richtig hilfreich, jetzt zu sagen, das ist nach Kontinenten einzuteilen.

00:24:23: Janika Kiltz Ja, es lässt sich wohl nur schwer pauschal ausdrücken. Dennoch gibt es Ungleichheiten. Wie können sich diese auswirken?

00:24:33: Prof. Dr. Tobias Marschall Ja, auch hier kann man schwer eine sehr pauschale Antwort geben, aber was natürlich richtig ist, ist, dass es bestimmte genetische Varianten gibt, die in manchen Populationen häufiger sind, als in anderen. Und das heißt im Grunde, dass dann sich auch die Chance, dass ich die entsprechenden Varianten richtig analysiere, unterschiedlich verteilt sein können. Man kann jetzt gar nicht mal direkt sagen, es ist zwingend die Bevölkerungsgruppe benachteiligt dadurch, oder die andere hat einen Vorteil. Ich glaube, es würden alle Bevölkerungen im Grunde davon profitieren, wenn man ein System von Referenzgenomen hätte, das all diese Sequenz, die wir inzwischen kennen, die in menschlichen Genomen quer über diesen Globus existiert, dass all diese Sequenz berücksichtigen und in die Analysen mit einbeziehen. Was man auch wissen muss, die meisten Sequenzvarianten, die es gibt in der globalen menschlichen Population, kommen auch in allen Ländern vor. Es gibt sehr wenige Beispiele von Sequenzvarianten und die müssen dann sehr selten sein, die wirklich spezifisch für eine Population sind. Wir reden hier wirklich einfach nur davon, dass vielleicht in manchen Teilen der Erde eine Sequenzvariante häufiger ist, als in einem anderen Teil der Erde. Aber dazu ist der Stammbaum der Menschheit zu kurz, als dass es jetzt wirklich Teile der Erde gibt, wo sich menschliche Genome wahnsinnig weit auseinanderentwickelt hätten. Das wäre ein falsches Bild.

00:26:16: Janika Kiltz Genau. Dennoch bringt es Probleme mit sich, dass das lineare Referenzgenom nicht die Diversität des Menschen abbilden kann. Beispielsweise werden bisher bei jeder Sequenzierung Varianten verworfen, die sich nicht dem Referenzgenom zuordnen lassen. Wir haben das bereits angesprochen, aber die Puzzleteile, die nicht passen, ja, die fallen heraus und das führt dann dazu, dass es noch einiges gibt, das wir über das menschliche Genom einfach nicht wissen. Was man ebenfalls nicht vergessen darf, auch wenn ich mich jetzt etwas vom humanen Referenzgenom entferne, also was man ebenfalls nicht vergessen darf, ist, dass Studien überwiegend an Teilnehmern europäischer Herkunft durchgeführt wurden. Das heißt, die meisten sequenzierten Daten, die wir haben und auf deren Grundlage auch geforscht wird, ja, die meisten davon stammen von Europäern. Das europäische Genom ist also besonders gut erforscht. Ja, also Zusammenhänge von krankmachenden Genen, Informationen zu möglichen Krankheitsverläufen, ja, das ist alles Wissen, das größtenteils auf dem europäischen Genom beruht. Und in der Praxis kann sich dieser Informationsunterschied so auswirken, dass man beispielsweise die Gesundheitsrisiken für Personen anderer Ethnizitäten schlechter beurteilen kann. Prognosen zum Krankheitsverlauf sind ungenauer, da nicht alle Varianten mit einbezogen werden oder sich Krankheiten bei verschiedenen Populationsgruppen auch etwas anders äußern können. Wie wahrscheinlich ist es, dass eine bestimmte Person eine bestimmte Krankheit entwickelt? Je mehr sich die besagte Person von den bisher analysierten Datensätzen unterscheidet, desto ungenauer werden die Aussagen. Besonders betroffen ist hier beispielsweise die indigene Bevölkerung Australiens. Das heißt, die Studien lassen sich nicht immer eins zu eins übertragen, was eben auch den Erfolg von Therapien beeinflussen kann. Ja, und das wiederum heißt, wir brauchen dringend mehr Diversität in der Genomforschung, vor allem, da wir ja auch alle von einem Zugewinn an Wissen profitieren würden. Aber zurück zum Referenzgenom. Ja, es besteht Verbesserungsbedarf und hier kommt das Pangenome Project ins Spiel, an dem auch meine Gäste beteiligt sind. Ja, die beiden arbeiten an einem pangenomischen Referenzgenom, könntet ihr erklären, was ein Pangenom ist und welche Idee hinter dem Pangenome Project steckt?

00:28:44: Jana Ebler Genau, also die Idee ist, dass man jetzt nicht nur ein einziges Referenzgenom hat, also eine einzige Sequenz, sondern dass man ein sogenanntes Pangenom hat. Das heißt, die Idee ist, dass wir quasi Informationen von mehreren Genomen, die man schon kennt, kombinieren und jetzt eben diese ganze Information benutzt, anstatt nur eine einzige Referenz zu benutzen. Und das hat eben den Vorteil, dass wir mehr von diesen genetischen Varianten oder halt diesen unterschiedlichen Sequenzen, die man in einer Population sieht, dass man das halt eben alles repräsentieren kann in so einem Pangenom. Was eben mit der linearen Referenz vorher nicht so war, weil wir da halt eben nur eine einzige Version darstellen konnten, aber nicht die unterschiedlichen Sequenzvarianten, die man halt auch sehen kann, wenn man jetzt sich die Genome von verschiedenen Menschen anschaut.

00:29:41: Prof. Dr. Tobias Marschall Ja, wie der Name schon sagt, hat es sich zum Ziel gesetzt, ein menschliches Pangenom zu erstellen. Der Begriff „Pangenom“ kommt eigentlich aus der Welt der Bakterien. Also da hat man, wie eine viel größere genetische Diversität als bei Menschen und da hat man schon lange diese Idee, dass man ein Pangenom, was dann sozusagen das gesamte genetische Material innerhalb einer Spezies beschreibt, dass man das zusammentragen will. Dieser Begriff hat ja, ich würde sagen, in den letzten zehn Jahren auch mehr und mehr Anwendung gefunden für den Bereich der menschlichen Genomik. Wir sind jetzt in der glücklichen Lage, dass die Technologie im Grunde inzwischen an einem Punkt ist, wo sich die wirklich umsetzen lässt, weil wir haben in den letzten, ich würde sagen, fünf Jahre enorme Fortschritte gemacht, menschliche Genome überhaupt neu assemblieren zu können. Also sozusagen alles, was bis dahin gelaufen ist, war eine… wir nennen das Resequenzierung. Das heißt, man macht genau das, man sequenziert und vergleicht die einzelnen Sequenzstücke, die man aus einem Sequenziergerät bekommt, mit dem Referenzgenom. Jetzt sind wir technologisch an einem Schritt, wo wir das ohne Referenzgenom ein neues Genom einer Person zusammensetzen können. Und das bringt uns in eine Position, an der wir jetzt wirklich ein Pangenom konstruieren können. Und das tut dieses Konsortium. Das wird finanziert vom NHGRI, also in einem Institut des NIH in Amerika und hatte sich zum Ziel gesetzt, 350 Menschen zu sequenzieren mit solchen Technologien, die lange Reads erzeugen, die es uns ermöglichen, diese Genome ohne Zuhilfenahme eines Referenzgenoms zusammenzusetzen. Und das gäbe uns dann jetzt 350 mal 2. Wir haben eben gesagt, der Mensch ist diploid mit zwei Genomen pro Mensch. Das heißt, wir haben dann 700 Versionen von Genomen, von real existierenden Menschen und können das zusammensetzen zu dem, was wir ein Pangenom nennen, also nämlich eine Repräsentation, nicht allen, aber der gängigsten Varianten der Menschheit im Grunde. Da wollte ich noch hinzufügen, mit natürlich dem Ziel, die verwendeten Samples so auszuwählen, dass sie möglichst divers sind.

00:32:12: Janika Kiltz Ein Pangenom bildet also gleichzeitig viele Genome ab und außerdem wird es oft durch einen Graphen dargestellt: Linien, Knoten und Kanten veranschaulichen die Varianten mehrerer Genome gleichzeitig, also so ähnlich, wie man das noch aus der Schule kennt, in einem Koordinatensystem. Nur eben, dass man mit diesem Graphen direkt viele Genome auf einmal betrachten kann. Ja, und im Gegensatz zum linearen Referenzgenom ist dieser Ansatz also deutlich flexibler und auch diverser. Aber wie kann man sich denn jetzt diesen Pangenom-Puzzle-Prozess eigentlich vorstellen? Werden da ganze Genome ausgewählt oder einzelne Abschnitte zusammengeschnitten? Ja, also wie stellt man ein pangenomisches Referenzgenom überhaupt her?

00:33:00: Prof. Dr. Tobias Marschall Das ist eine super spannende Frage. Zum Teil… In Teilen sind die Antworten, würde ich sagen, noch offen, was jetzt letztlich der beste Weg ist, das zu tun. Wir haben natürlich Möglichkeiten, das zu tun. Also in Kürze, was dieses Konsortium tut, ist, es löst erstmal jedes Puzzle einzeln. Also wir machen Genome Assemblies für alle teilnehmenden Probanden separat. Das heißt, wir haben jetzt Rekonstruktion von jedem Genom einzeln. Jetzt kann man, wenn man das einmal hat, natürlich unterschiedliche Strategien verfolgen, die auch alle verfolgt werden und die alle auch verschiedene Stärken und Schwächen haben. Man kann natürlich jetzt zunächst mal alle diese Genome, die wir jetzt haben, mit dem althergebrachten Referenzgenom vergleichen. Das hat natürlich den Nachteil, dass es im Grunde alle Schwächen, die das Referenzgenom hatte, die wir eben besprochen haben, wieder mitbringt zu einem gewissen Grad. Aber es hat natürlich den Vorteil, dass wir jetzt ein sehr viel vollständigeres Bild kriegen, weil wir jetzt ganze Genome miteinander vergleichen können und nicht kleine Sequenzschnipsel. Das passiert im Grunde und diese Varianten, die da rauskommen, die werden auch der Forschergemeinde zur Verfügung gestellt. Eine andere Möglichkeit ist natürlich jetzt, ganz neue Wege zu gehen und andere Datenstrukturen aufzubauen, die viel mit Graphen zu tun haben. Und jetzt gibt es viele Ideen, wie man jetzt unser lineares Referenzgenom, also unsere Folge von Buchstaben, ersetzen kann durch eine Datenstruktur, die durch so einen Graphen definiert ist. Man kann sich das vorstellen, man hat kleine Sequenzstücke. Also ich schreibe mir jetzt viele Sequenzstücke auf ein Blatt Papier und ich verbinde jetzt die, die ich in einem Genom in dieser Reihenfolge gesehen habe durch Linien. Das heißt, ich kriege jetzt viele Sequenzen mit einem Bündel von verschiedenen Linien dadurch. Jede Linie ist ein Referenzgenom und kriegt dann also so eine Struktur mit Knoten und Kanten. Und das ist im Grunde die Vision, dass alles, was wir jetzt im Moment tun, in Bezug auf unser althergebrachtes Referenzgenom, was man in Zukunft in Bezug auf solche Graphen tun kann, die dann ein sehr viel vollständigeres Bild uns liefern.

00:35:26: Janika Kiltz Welche Herausforderungen bringt das Erstellen eines pangenomischen Referenzgenoms denn eigentlich mit sich? Weil, also ich kann mir vorstellen, dass das gar kein so leichtes Unterfangen ist.

00:35:36: Prof. Dr. Tobias Marschall Das ist richtig. Ich meine, es gibt wieder verschiedene Aspekte, auf denen das herausfordernd ist. Der erste ist natürlich die reine, ich sage mal, das Erfinden von Algorithmen und Methoden, die das wirklich können und die Implementierung entsprechender Software. Das ist einfach ein Entwicklungsprozess, der Zeit in Anspruch nimmt, Zeit, die man für die normalen Referenzgenome schon investiert hat und jetzt einfach neu investieren muss. Das ist natürlich eine Herausforderung, insbesondere weil auch aus informatisch-theoretischer Sicht manchmal die Probleme einfach schwieriger sind. Manches, was in Bezug auf eine Sequenz einfach ist, ist in Bezug auf einen Graphen schwierig. Ich denke, da machen wir aber schon gute Fortschritte und da hat das Feld viele Fortschritte gemacht. Jetzt eine Herausforderung bei der Interpretation der Genome. Die Frage, die man im Grunde beantwortet, wenn man so eine Graphstruktur bauen will, ist, welche Sequenzstücke lassen sich auf einen gemeinsamen Vorfahren zurückverfolgen? Also wenn wir uns jetzt vorstellen, unsere beiden Genome werden da repräsentiert und die Pfade durch diese Struktur, die unsere Genome jeweils repräsentieren, die laufen durch einen gemeinsamen Knoten. Was wir damit sagen, also was die Interpretation wäre, ist, dieses Sequenzstückchen lässt sich jetzt zurückverfolgen auf einen gemeinsamen Vorfahren von uns beiden irgendwann in der jüngeren oder nicht so jungen Vergangenheit. Das heißt, diese Struktur, der wohnt eigentlich eine biologische Interpretation inne. Das heißt, das zu machen kann entweder richtig sein oder falsch. Und ob es das ist und wie man das validiert, ist eine offene Frage, an der viele Leute arbeiten. Die dritte Herausforderung ist jetzt im Grunde die, wie man das unter die Leute bringt. Selbst wenn wir, im Sinne von die engere Bioinformatik-Community, die an solchen Fragen arbeitet, wenn die das im Griff hat, wie kriegt man das sozusagen auf die Straße, dass das dann auch in klinischen Anwendungen und darüber hinaus verwendet wird. Und das ist im Grunde, ja, noch ein weiteres Thema.

00:37:55: Janika Kiltz Die Erstellung eines Pangenoms ist also mit einigen Schwierigkeiten verbunden. Wie sieht es aber mit der Nutzung aus? Musste ich um beispielsweise diesen Graphen richtig verwenden zu können, auch mit einer gewissen Rechenleistung ausgestattet sein?

00:38:08: Jana Ebler Also ich würde schon sagen, dass die Verwendung des Pangenoms nach jetzigem Stand sehr viel komplizierter ist, als einfach ein lineares Referenzgenom zu benutzen. Auch, weil man die Methoden, also all diese Algorithmen, die wir haben, um mit dem linearen Referenzgenom zu arbeiten, viele dieser Methoden, die müssen erst noch angepasst werden, sodass sie eben Pangenome auch verarbeiten können. Die Struktur eines Pangenoms ist natürlich komplexer, und diese Genome sind größer. Und viele Algorithmen, die sind eben darauf abgeschnitten, dass wir… oder dafür entwickelt worden, ein lineares Referenzgenom zu analysieren. Und wenn wir jetzt aber irgendwie einen mehrdimensionalen Graph haben, dann wird das halt alles komplizierter. Das heißt, es ist schon noch sehr viel Arbeit nötig, die ganzen Algorithmen, die wir jetzt haben, weiterzuentwickeln, sodass sie auch auf Pangenome angewendet werden können.

00:39:06: Janika Kiltz Achso, ja, gibt es denn hier schon einige angepasste Algorithmen?

00:39:11: Jana Ebler Genau, also es gibt tatsächlich schon einige Methoden und Algorithmen, die für Pangenome entwickelt wurden, aber es gibt auch schon noch sehr viele Bereiche, in denen noch sehr viel Arbeit nötig ist.

00:39:23: Janika Kiltz Ja, wagen wir noch einen kleinen Blick in die Zukunft. Wir hatten ja schon angesprochen, dass noch einige Forscherinnen und Forscher das alte Referenzgenom Nummer 37, verwenden, obwohl schon seit einiger Zeit eine aktuellere Version erhältlich ist. Wie ist denn eure Prognose beim pangenomischen Referenzgenom? Wir hatten ja gehört, dass da auch gewisse technische Rahmenbedingungen eingehalten werden müssen. Wird der Umstieg hier schnell vonstattengehen?

00:39:51: Jana Ebler Also ich bin schon zuversichtlich. Ich denke, es wird wahrscheinlich schon noch eine Weile dauern, bis das alles umgestellt werden kann. Aber ich denke, auf längere Sicht wird wahrscheinlich das Pangenom das lineare Referenzgenom ersetzen, einfach, weil es so viele Vorteile gibt. Es hat sich auch schon gezeigt, auch in unseren Analysen, dass viele Analysen eben verbessert werden können, wenn wir ein Pangenom benutzen, anstatt eines linearen Referenzgenoms. Auch gerade, wenn wir jetzt diese Regionen in der DNA analysieren möchten, die eben sehr variabel sind, also sehr unterschiedlich sein können zwischen verschiedenen Menschen. Gerade da ist es eben sehr, sehr hilfreichen, ein Pangenom zu haben. Und deswegen glaube ich schon, dass auf längere Sicht das Referenzgenom ersetzt werden wird dadurch.

00:40:40: Prof. Dr. Tobias Marschall Also es muss natürlich auch klar sein, was die Vorteile sind. Und genau das ist natürlich eine Sache, die wir jetzt auch in der aktuellen Veröffentlichung, wo die erste Version dieses Pangenoms jetzt erscheint, tun, dass wir demonstrieren, was der Vorteil daran ist. Und ein Vorteil ist zum Beispiel, wir haben schon von strukturellen Varianten gesprochen, also das heißt, die Unterschiede zwischen Genomen, die jetzt mehr als 50 Basenpaare ausmachen. Wir finden zum Beispiel, dass man, wenn man ein Genom relativ zu einem Standardreferenzgenom analysiert, man ungefähr 10.000 solche strukturellen Varianten identifizieren kann mit einem normalen Whole genome sequencing. Wenn wir jetzt aber unsere Methoden und so ein Pangenom verwenden, finden wir ungefähr 18.000 solcher Unterschiede. Und das heißt, wir verpassen fast die Hälfte. Im Grunde verpassen wir noch mehr, weil auch diese Methoden nicht perfekt sind. Das ist zum Beispiel eine Anwendung, wo man jetzt auch, denke ich, viele Leute nachdenklich werden, denken, wir haben wirklich so viel immer verpasst. Haben wir fast die Hälfte der strukturellen Varianten verpasst? Das könnte eine Motivation sein, umzuschalten. Und je mehr dann auch klar wird, was das für klinische Bedeutung haben könnte, solche zusätzlichen Varianten mit einzubeziehen, desto mehr wird, denke ich, auch die Bereitschaft, umzusteigen. Je mehr vielleicht auch klar wird, dass es im Grunde aus meiner Sicht auch schwerwiegende ethische Probleme mit sich bringt, es nicht zu tun, weil wir noch sonst gar nicht wirklich sagen könnten, welche Bevölkerungsgruppen vielleicht benachteiligt werden durch die Verwendung dieses Referenzgenoms. Das ist ein weiteres Argument, das meines Erachtens auch so schwerwiegend ist, dass es eigentlich dazu führen muss, dass das mittelfristig geschafft wird, dieser Umstieg.

00:42:56: Janika Kiltz Welche Auswirkungen könnte der Umstieg haben?

00:43:00: Prof. Dr. Tobias Marschall Es wird sicherlich verschiedene Auswirkungen haben in verschiedenen Bereichen. Also es gibt ja einmal den Bereich die seltenen Erkrankungen und die Aufklärungsraten bei seltenen Erkrankungen sind ja auch relativ klein, oder zumindest deutlich kleiner, als wir es uns wünschen würden. Hier können natürlich zum einen solche pangenomischen Referenzen helfen, zum anderen natürlich auch neue Sequenziertechnologien mit längeren Reads. Diese Kombination wird aus meiner Sicht in den nächsten fünf Jahren auch für seltene Erkrankungen sicherlich große Chancen bieten. Der andere Bereich sind natürlich die häufigen Erkrankungen, also solche Dinge wie das Risiko, einen Herzinfarkt zu erleiden, oder das Risiko, Diabetes zu bekommen. Da wissen wir, dass diese Dinge, solche Risiken in der Regel polygenisch sind. Das heißt, das sind Varianten, die sich aufs Ganze Genom verstreuen, aber auch da gibt es Beispiele, dass die Varianten oder entscheidende Varianten gar nicht mit einbezogen werden in solche Risiko-Bewertungen. Und da gibt es auch eine Chance in solchen Studien, die die Assoziation zwischen genetischen Varianten und solchen gängigen oder Risiken für gängige Erkrankungen, dass solche Studien auch davon profitieren, indem sie eben mehr Varianten jetzt mit einbeziehen können und vielleicht einen größeren Teil der Erblichkeit auch solcher häufigen Volkskrankheiten, sag ich mal, mit einbeziehen und aufklären können.

00:44:32: Janika Kiltz Das heißt, wir bleiben wie immer gespannt, was die Zukunft noch so mit sich bringt und auch wie die Forschung in den nächsten Jahren auf den Umschwung zum pangenomischen Referenzgenom reagieren wird. Ich bedanke mich bei meinen Gästen, Professor Tobias Marschall und Jana Ebler. Bis zum nächsten Mal! Dieser Podcast wurde präsentiert von GHGA. Wir bieten Infrastruktur, in welcher Genomdaten sowie weitere medizinische Daten sicher gespeichert und kontrolliert zugänglich gemacht werden können. Das Projekt wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft finanziert und ist Teil der Nationalen Forschungsdateninfrastruktur. Weitere Informationen findet ihr unter www.ghga.de Vielen Dank fürs Zuhören und herzlichen Dank an unsere heutigen Gäste, Professor Tobias Marschall und Jana Ebler. Bis zum nächsten Mal!